Μελέτη του ρόλου της ινσουλινο-εξαρτώμενης οδού σηματοδότησης σε ανθρώπινα επιθηλιακά νεφρικά κύτταρα και in vivo σε νεφρικά επιθηλιακά ποδοκύτταρα νεφρών διαβητικών ποντικών db/db ή επίμυων Zucker (μοντέλο ΣΔΤ2)

 

Ερευνητική ομάδα

  • Δρ. Φωτεινή-ΈφηΤσιλιμπάρη, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών & Εφαρμογών, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. “Δημόκριτος”. Υπεύθυνη Ερευνητικής Ομάδας. Επιβλέπουσα όλων των διαδικασιών

  • Δρ. Γαρυφαλιά Δροσποπούλου :  Κύριο Μέλος Ερευνητικής Ομάδας. Επίβλεψη πειραμάτων και ανάλυση αποτελεσμάτων.

  • Δρ. Δημήτριος Βλαχάκος :  Επίβλεψη ζωικού μοντέλου Σακχαρώδους Διαβήτη Τύπου 2 (ΣΔΤ2)

  • Δρ. Ηλίας Κατσουλιέρης :  Μεταδιδακτορικός Ερευνητής. Διεξαγωγή των πειραμάτων υπό την επίβλεψη Γ. Δροσοπούλου και Ε.Φ.Κ. Τσιλιμπάρη

  • Ελένη Κωτσοπούλου : Τεχνικός

     

Αντικείμενο

 

Τα ποδοκύτταρα αποτελούν κομβικά κύτταρα της λειτουργικής μονάδας του νεφρού και εμπλέκονται στη νεφρική παθολογία. Η φυσιολογική μορφολογία και λειτουργική ικανότητα αυτών των κυττάρων είναι πρωταρχικής σημασίας για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Η λειτουργία των ποδοκυττάρων στηρίζεται στην εξειδικευμένη μορφολογία αυτών, η οποία αποτελείται από την παρουσία πολλαπλών πρωτογενών και δευτερoγενών προεκβολών (footprocesses). Επιπλέον οι ποδοειδείς προεκβολές συνδέονται μεταξύ τους με τα διαφράγματα ή σχισμές διήθησης (slitdiaphragms), που αποτελούν κομβικές δομές για τη λειτουργία εκλεκτικής διαπερατότητας του νεφρικού ηθμού (Holthöfer H. NephrolDialTransplant. 2124-28 2007). Η πολύπλοκη δομή των σχισμών διήθησης οι οποίες περιλαμβάνουν πολλές διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, αποτελεί το μείζονα φραγμό στην απώλεια πρωτεϊνών από το πλάσμα προς τα ούρα. Όπως είναι γνωστό, πολλές χρόνιες νεφρικές παθήσεις χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργία των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων/ποδοκυττάρων, η οποία εκδηλώνεται με πρωτεϊνουρία και με μορφολογικές (MarshallSM. HormMetabRes. 37 Suppl1 9-16, 2005). Η κοινότερα απαντώμενη μορφολογική αλλοίωση είναι η ελάττωση ή απώλεια των ποδοειδών προεκβολών, που συνοδεύεται από ελάττωση ή απώλεια των σχισμών διήθησης.

_

Καταστάσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από την παρουσία μορφολογικών αλλοιώσεων των ποδοκυττάρων και ειδικότερα από απώλεια των ποδοειδών προεκβολών είναι η εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση (focal/segmental glomerulosclerosis) το σύνδρομο Denys-Drash, και η συχνά απαντώμενη διαβητική νεφροπάθεια (Gambaro G and Van Der Woude FJ, J. Am. Soc. Nephrol. 359-368, 2000). Η διαβητική νεφροπάθεια εμφανίζεται στο 20-40% των ασθενών που πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη και θεωρείται ως μία από τις συχνότερες αιτίες της Νεφρικής Νόσου Τελικού Σταδίου (ESRD) (Gambaro G and Van Der Woude FJ, 2000). Επιπλέον στη διαβητική νεφροπάθεια όπως και σε άλλες χρόνιες παθήσεις του σπειράματος, τα ποδοκύτταρα εμφανίζουν απόπτωση και αυτό έχει ως συνέπεια την επιβάρυνση της νεφρικής νόσου λόγω μείωσης του αριθμού των ποδοκυττάρων.

_

Η νεφρίνη, αποτελεί κεντρικό συστατικό του διαφράγματος και λειτουργεί ως επιφανειακός υποδοχέας και μεταβιβάζει σήματα προς το εσωτερικό των κυττάρων που απενεργοποιούν τον αποπτωτικό παράγοντα Bad διά μέσου φωσφορυλίωσης από την κινάση σερίνης-θρεονίνης Akt, προστατεύοντας έτσι τα ποδοκύτταρα από απόπτωση (Lahdenperä Jetal., KidneyInt 64:404, 2003). Κατά συνέπεια, η απρόσκοπτη ενεργοποίηση της κινάσης Akt είναι απαραίτητη για την επιβίωση των νεφρικών ποδοκυττάρων. Επιπροσθέτως η νεφρίνη είναι απαραίτητη για τη δράση της ινσουλίνης στα ποδοκύτταρα, δεδομένου ότι ποδοκύτταρα από ασθενείς με μεταλλάξεις του γονιδίου της νεφρίνης δεν παρουσίασαν ανταπόκριση σε ερέθισμα ινσουλίνης. Επιπλέον καταστολή της έκφρασης ινσουλίνης με siRNA σε φυσιολογικά ποδοκύτταρα κατάργησε την απόκριση σε ερέθισμα ινσουλίνης, ενώ επιμόλυνση ποδοκυττάρων με νεφρίνη επανέφερε την απόκριση σε ερέθισμα ινσουλίνης. Κατά συνέπεια η δράση της ινσουλίνης είναι σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία των ποδοκυττάρων, και μπορεί να συμμετέχει στα αρχικά στάδια ανάπτυξης της διαβητικής νεφροπάθειας.

_

Σύμφωνα με τα ανωτέρω στόχος μας είναι η μελέτη του ρόλου της ινσουλινο-εξαρτώμενης οδού επιβίωσης σε νεφρικά ποδοκύτταρα, τα οποία αποπίπτουν με την ανάπτυξη διαβητικής νεφροπάθειας.

_

Για τη διερεύνηση τέτοιων φαινομένων χρησιμοποιούμε μια κυτταρική σειρά αθανατοποιημένων ανθρώπινων ποδοκυττάρων: ανθρώπινα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα (ποδοκύτταρα) αθανατοποιημένα με τον ιό TSV-40 (HGEC, HumanGlomerularEpithelialCells, DelarueFet.al. KidneyInt. 40: 906-912, 1991 ; EconomouCGet. al. JCellSci. 117: 3281-3294, 2004; Drossopoulou G et. al. Am J Physiol Renal Physiol. 97:594-603 2009). Τα HGEC μπορούν να καλλιεργηθούν παρουσία φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης (5mM) ή υψηλών/διαβητικών επιπέδων γλυκόζης (25mM). Οι μέχρι τώρα μελέτες μας έχουν δείξει σημαντικά μειωμένα επίπεδα τόσο του μεταγράφου όσο και της πρωτεΐνης της νεφρίνης μετά από συνεχή καλλιέργεια των HGEC σε 25mM γλυκόζης. Παράλληλα η χρόνια έκθεση ποδοκυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης οδήγησε σε μείωση της ινσουλινο-επαγόμενης φωσφορυλίωσης των καταλοίπων της τυροσίνης στην περιοχή της κινάσης του υποδοχέα της ινσουλίνης και στην αλλοίωση των πρώιμων σταδίων σηματοδότησης της ινσουλίνης μέσω μειωμένης φωσφορυλίωσης/ενεργοποίησης του IRS-2. Οι γλυκοζο-επαγόμενες αλλοιώσεις της ενεργοποίησης του IRS-2 συνοδεύτηκαν από δραματική μείωση της ενεργοποίησης της διασυνδεδεμένης με τον IRS-2 της Akt κινάσης, με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της αναστολής των μεταγραφικών παραγόντων FOXO1 ή/και FOXO3α. Τα δεδομένα αυτά συνοδεύτηκαν από αυξημένη ευαισθησία των ποδοκυττάρων στην απόπτωση σε συνθήκες ήπιου κυτταρικού στρες, όπως έδειξαν αποτελέσματα μελέτης του κατακερματισμού της πρωτεΐνης PARP.

_

Συνολικά, τα ανωτέρω αποτελέσματα αφενός προτείνουν ένα μηχανισμό σύμφωνα με τον οποίο η γλυκοζο-επαγόμενη μειορύθμιση της ενδογενούς νεφρίνης μπορεί να οδηγεί σε αυξημένη απόπτωση των ποδοκυττάρων μέσω καταστολής της σηματοδότησης διαμέσου IRS-2 και Akt και αφετέρου, δείχνουν ότι οι γλυκοζο-επαγόμενες αλλοιώσεις του συστήματος σηματοδότησης της ινσουλίνης πιθανόν να συμβάλλουν στην απόπτωση των ποδοκυττάρων κατά τη φυσική πορεία του διαβήτη τύπου 2.